本发明在治疗性抗体开发的经验基础上,利用当代现有的科学技术研制的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)
1.一种抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂,以重组SEB即rSEB或天然SEB即nSEB或重组SEB即rSEB和天然SEB即nSEB以等量混合为免疫原制备的,其特征在于:所述重组SEB即rSEB免疫原是通过如下步骤制备得到:(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,36-38°C,培养11-13h后,以0.5%-2%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,30°C-35°C,1.0mM的IPTG诱导表达8h-11h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达43%-50%,3°C-6°C放置4-6h,11000-13000rpm离心8-12min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到70%-80%,3°C-6°C放置4-6h,11000-13000rpm离心8-12min,取沉淀;(3)将经过70%-80%的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至150g/ml-200g/ml;将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以0.5ml/min-2ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经缓冲液A(5mMxa0PB,pH7.2)3°C-6°C,11-13小时透析后,以3ml/min-8ml/min的流速上已平衡的SP即聚羟甲基丙烯酸酯阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用缓冲液B(5mMxa0PB,0.5Mxa0NaClxa0pH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;得纯化后rSEB纯品。所述天然SEB即nSEB免疫原是通过如下步骤制备得到:(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,36-38°C培养11h-13h后,以0.5%-2%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,36°C-38°C孵育45h-50h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,11000-13000rpm离心12-18min,取上清液用聚乙二醇8000浓缩25-35倍,置截留量4000-6000的透析袋中,在3°C-6°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;xa0(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为20ml/h-30ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取1/10-1/100凝胶过滤柱体积的粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75即葡聚糖凝胶G-75,用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为5ml/h-10ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,3°C-6°C保存备用;所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂,通过如下方法制备得到:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔18-23天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg;当免疫动物ELISA效价达1∶64000-1∶128000时采集血浆,-78°C--70°C保存备用;(2)向血浆中加入体积比1/10的S/D病毒灭活溶液灭活外源病毒,后加入0.070%-0.080%%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入饱和度21%的硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心得沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5-1/10,即为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.0-3.5后,用胃蛋白酶切割,再用1M氢氧化钠调PH至7.0-7.6,加热55-60°C、25-35min,用帆布过滤,滤液为初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow即二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶层析,柱平衡后,样品液上柱,用由10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)缓冲液线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤除盐、浓缩,用0.20μm-0.24μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。xa0
2.如权利要求1所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂,其特征在于所述重组SEB即rSEB免疫原是通过如下步骤制备得到:(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,37°C,培养12h后,以1%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,32°C,1.0mM的IPTG诱导表达10h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达45%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到75%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,取沉淀;(3)将经过75%饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至200g/ml;将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以1ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经缓冲液A(5mMxa0PB,pH7.2)4°C透析12h后,以5ml/min的流速上已平衡的SP即聚羟甲基丙烯酸酯阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用缓冲液B(5mMxa0PB,0.5Mxa0NaClxa0pH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;得纯化后rSEB纯品。
3.如权利要求1或2所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂,其特征在于所述天然SEB即nSEB免疫原是通过如下步骤制备得到:(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,37°C培养12h后,以1%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,37°C孵育48h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,12000rpm离心15min,取上清用聚乙二醇8000浓缩30倍,置截留量5000的透析袋中,在4°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为25ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取1/10-1/100凝胶过滤柱体积的粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75即葡聚糖凝胶G-75,用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为xa08ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,4°C保存备用。
4.如权利要求1或2所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂,其特征在于通过如下方法制备:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg;当免疫动物ELISA效价达1∶64000-1∶128000采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10的S/D病毒灭活溶液灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵,混匀、离心弃沉淀,上清再加入9%饱和度硫酸铵,混匀,离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心、沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5,即为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow即二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)配制的缓冲液进行线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤,浓缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。
5.如权利要求3所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂,其特征在于通过如下方法制备:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg;当免疫动物ELISAxa0效价达1∶64000-1∶128000采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10的S/D病毒灭活溶液灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵,混匀、离心弃沉淀,上清再加入9%饱和度硫酸铵,混匀,离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心、沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5,即为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow即二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)配制的缓冲液进行线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤,浓缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。
6.一种抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于该方法为:以重组SEB即rSEB或天然SEB即nSEB或重组SEB即rSEB和天然SEB即nSEB以等量混合为免疫原制备抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂;所述重组SEB即rSEB免疫原的由如下方法制备:(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,36-38°C,培养11-13h后,以0.5%-2%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,30°C-35°C,1.0mM的IPTG诱导表达8h-11h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达43%-50%,3°C-6°C放置4-6h,11000-13000rpm离心8-12min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到70%-80%,3°C-6°C放置4-6h,11000-13000rpm离心8-12min,取沉淀;xa0(3)将经过70%-80%的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至150g/ml-200g/ml;将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以0.5ml/min-2ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经缓冲液A(5mMxa0PB,pH7.2)3°C-6°C,11-13小时透析后,以3ml/min-8ml/min的流速上已平衡的SP即聚羟甲基丙烯酸酯阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用缓冲液B(5mMPB,0.5Mxa0NaClxa0pH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;得纯化后rSEB纯品。所述天然SEB即nSEB免疫原由如下方法制备:(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,36-38°C培养11h-13h后,以0.5%-2%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,36°C-38°C孵育45h-50h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,11000-13000rpm离心12-18min,取上清液用聚乙二醇8000浓缩25-35倍,置截留量4000-6000的透析袋中,在3°C-6°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为20ml/h-30ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取1/10-1/100凝胶过滤柱体积的粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75即葡聚糖凝胶G-75,用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为5ml/h-10ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,3°C-6°C保存备用;所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法包括如下步骤:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔18-23天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg;当免疫动物ELISA效价达1∶64000-1∶128000时采集血浆,-78°C--70°C保存备用;(2)向血浆中加入体积比1/10的S/D病毒灭活溶液灭活外源病毒,后加入0.070%-0.080%%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入饱和度21%的硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度xa0硫酸铵混匀离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心得沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5-1/10,即为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.0-3.5后,用胃蛋白酶切割,再用1M氢氧化钠调PH至7.0-7.6,加热55-60°C、25-35min,用帆布过滤,滤液为初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow即二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶层析,柱平衡后,样品液上柱,用由10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)缓冲液线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤除盐、浓缩,用0.20μm-0.24μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。
7.如权利要求6所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于该方法中所述的rSEB抗原由如下方法制备:(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,37°C,培养12h后,以1%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,32°C,1.0mM的IPTG诱导表达10h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达45%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到75%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,取沉淀;(3)将经过75%饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至200g/ml;将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以1ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经缓冲液A(5mMxa0PB,pH7.2)4°C透析12h后,以5ml/min的流速上已平衡的SP即聚羟甲基丙烯酸酯阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用xa0缓冲液B(5mMxa0PB,0.5Mxa0NaClxa0pH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;得纯化后rSEB纯品。
8.如权利要求6或7所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂的制备方法,其特征在于该方法中所述的天然SEB即nSEB免疫原是通过如下步骤制备得到:(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,37°C培养12h后,以1%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,37°C孵育48h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,12000rpm离心15min,取上清用聚乙二醇8000浓缩30倍,置截留量5000的透析袋中,在4°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为25ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取1/10-1/100凝胶过滤柱体积的粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75即葡聚糖凝胶G-75,用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为8ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,4°C保存备用。
9.如权利要求6或7所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于通过如下方法制备:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg;当免疫动物ELISA效价达1∶64000-1∶128000采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10的S/D病毒灭活溶液灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵,混匀、离心弃沉淀,上清再加入9%饱和度硫酸铵,混匀,离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心、沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5,即为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠xa0调PH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow即二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)配制的缓冲液进行线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤,浓缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。
10.如权利要求8所述的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab′)₂的制备方法,其特征在于通过如下方法制备:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg;当免疫动物ELISA效价达1∶64000-1∶128000采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10的S/D病毒灭活溶液灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵,混匀、离心弃沉淀,上清再加入9%饱和度硫酸铵,混匀,离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心、沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5,即为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow即二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)配制的缓冲液进行线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤,浓xa0缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。xa0技术领域:本发明属于生物技术制药领域,涉及一种抗金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫球蛋白F(ab’)₂及其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Saphylococcusxa0aureud)是引起人类感染和细菌性食物中毒的一种重要致病菌,在自然界中分布广泛。在欧美各国、日本、东南亚以及我国,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒时有发生。历年的食物中毒调查表明,由该菌引起的食物中毒事件在整个细菌性食物中毒中排在第一位或第二位。金黄色葡萄球菌的致病力主要取决于产生肠毒素的能力。据估计,进食者吃下约100ng肠毒素1-3h后即可出现食物中毒症状。金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcalxa0enterotoxinxa0B,SEB),是由金黄色葡萄球菌分泌的一种外毒素,是导致食物中毒的主要物质,能引起人呕吐、腹泻、腹痛甚至致死性休克等中毒症状。利用实验动物进行SEB检测发现,金黄色葡萄球菌肠毒素B对2-3kg小猴胃内半数呕吐量为5μg;腹腔注射幼猫致呕吐量为0.5μg;在LPS激发下,腹腔注射BALB/c小鼠,7.5-10μg相当于25-30的LD50,而滴鼻攻击,115-120μg仅相当于7-8LD50。天然SEB最早于1954年分离出来,1965年获得成功提纯,1970年测得其239个氨基酸序列,其分子量为28.3kDa,其基因序列直到1986年才测出。SEB是一种可溶性蛋白质,耐热,不受胰蛋白酶的影响。一般情况下,SEB刺激呕吐中枢会导致以呕吐为主要症状的食物中毒,并且SEB结合于肠壁上皮细胞的受体,激活肠上皮细胞膜上的腺苷酸环化酶,促进胞质内蛋白质磷酸化过程,引起一系列酶促反应,抑制肠上皮细胞对钠、水的吸收,促进肠液与氯离子分泌,引起腹泻症状。另外,SEB是一种细菌超抗原。它能多克隆激活T细胞,并与自身免疫性疾病的发生有关,不需经抗原提呈细胞(APC)处理,便可直接与APC上的MHCxa0II类分子相互作用,再与T细胞受体(TCR)上的某些β链可变区(Vβ)作用,从而非特异性地激活比普通抗原多数千倍的T细胞,并因释放过量细胞因子,产生毒副作用而致病。目前对于SEB中毒,临床上尚无特效的治疗药物和手段。自上世纪80年代,美国每年都投入大量资金资助SEB等生物医学防护领域的研究,加紧进行SEB疫苗、基因工程抗体、解毒药方面的研究并已经取得了相当的进展。根据人类历史与毒素斗争的经验,最有效而经济的手段之一是抗血清的被动免疫治疗,在某些重要毒素的治疗和预防上至今仍被使用,并发挥重要的作用。抗血清(又名抗免疫球蛋白)自古以来是用于重要毒素的一种有效的应急措施,至今多种抗血清在临床广泛应用,发挥重要的治疗和预防毒素的作用。抗血清发展经历了传统的整个抗体分子,发展到今天有效去掉能引起毒副作用的Fc段抗体分子和其它血浆杂蛋白分子,获得具有与毒素抗原特异结合的高纯度F(ab’)₂治疗抗体,达到中和毒素的效果。
发明内容
本发明目的在于公开一种抗SEB的免疫球蛋白F(ab’)₂,本发明的另一目的是公开了该特异性免疫球蛋白F(ab’)₂的制备方法。本发明目的是通过如下方案实现的:一种以SEB为免疫原制备的抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂。所述的SEB免疫原为重组SEB(rSEB)或/和天然SEB(nSEB)。所述rSEB免疫原是通过如下步骤制备得到:(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,36-38°C,培养11-13h后,以0.5%-2%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,30°C-35°C,1.0mM的IPTG诱导表达8h-11h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达43%-50%,3°C-6°C放置4-6h,11000-13000rpm离心8-12min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到70%-80%,3°C-6°C放置4-6h,11000-13000rpm离心8-12min,取沉淀;(3)将经过70%-80%的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至150g/ml-200g/ml。将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以0.5ml/min-2ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经缓冲液A(5mMxa0PB,pH7.2)3°C-6°C,11-13小时透析后,以3ml/min-8ml/min的流速上已平衡的SP(聚羟甲基丙烯酸酯)阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用缓冲液B(5mMPB,0.5Mxa0NaClxa0pH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;得纯化后rSEB纯品。所述rSEB免疫原优选通过如下步骤制备得到:(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,37°C,培养12h后,以1%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,32°C,1.0mM的IPTG诱导表达10h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达45%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到75%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,取沉淀;(3)将经过75%饱和度的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至200g/ml。将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以1ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经缓冲液A(5mMPB,pH7.2)4°C透析12h后,以5ml/min的流速上已平衡的SP(聚羟甲基丙烯酸酯)阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用缓冲液B(5mMxa0PB,0.5Mxa0NaClxa0pH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;得纯化后rSEB纯品。所述nSEB免疫原是通过如下步骤制备得到:(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,36-38°C培养11h-13h后,以0.5%-2%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,36°C-38°C孵育45h-50h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,11000-13000rpm离心12-18min,取上清液用聚乙二醇8000浓缩25-35倍,置截留量4000-6000的透析袋中,在3°C-6°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为20ml/h-30ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取1/10-1/100凝胶过滤柱体积的粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75(葡聚糖凝胶G-75),用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为5ml/h-10ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,3°C-6°C保存备用;所述nSEB免疫原优选通过如下步骤制备得到:(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,37°C培养12h后,以1%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,37°C孵育48h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,12000rpm离心15min,取上清用聚乙二醇8000浓缩30倍,置截留量5000的透析袋中,在4°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为25ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取1/10-1/100凝胶过滤柱体积的粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75(葡聚糖凝胶G-75),用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为8ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,4°C保存备用;一种抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂,通过如下方法制备:以SEB免疫健康动物获得的血浆,经病毒灭活、硫酸铵盐析、蛋白酶切割、柱层析纯化制备得到。一种抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂,通过如下步骤制备:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔18-23天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg。当免疫动物ELISA效价达1∶64000-1∶128000时采集血浆,-78°C--70°C保存备用;(2)向血浆中加入体积比1/10的S/D病毒灭活溶液(Tritonxa0X-10010%,TNBP3%)灭活外源病毒,后加入0.070%-0.080%%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入饱和度21%的硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心得沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5-1/10,即为纯化抗SEBIgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.0-3.5后,用胃蛋白酶切割,再用1M氢氧化钠调PH至7.0-7.6,加热55-60°C、25-35min,用帆布过滤,滤液为初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow(二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶)层析,柱平衡后,样品液上柱,用由10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)缓冲液线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤除盐、浓缩,用0.20μm-0.24μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。一种抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂,优选通过如下步骤制备:(1)nSEB或rSEB或nSEB和rSEB等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg。当免疫动物ELISA效价达1∶64000-1∶128000采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10(体积比)的S/D病毒灭活溶液(Tritonxa0X-10010%,TNBP3%)灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵,混匀、离心弃沉淀,上清再加入9%饱和度硫酸铵,混匀,离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原血浆体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心、沉淀IgG,先加入原血浆体积的无热源蒸馏水或加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤、浓缩至原血浆体积的1/5,即为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow(二乙基氨基乙基琼脂糖凝胶)层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)配制的缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)配制的缓冲液进行线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤,浓缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。所述的健康动物,可选自猪、羊、骆驼中的一种或几种。所述的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液,按照常规方法,制备抗SEB免疫球蛋白注射剂和粘膜剂型成品。本发明对纯化后rSEB纯品的纯化效果分析,经电泳测算其纯度大于98%,并测定蛋白质分子量,分子量约为28kDa;在腹腔注射75μgxa0LPS激发下,通过腹腔注射、滴鼻攻击BALB/c小鼠测定rSEB毒性,半数致死量LD50分别为25μg/kg、750μg/kg。本发明还对纯化后nSEB纯化效果分析,经电泳测算其纯度大于95%,并测定蛋白质分子量,分子量约为28kDa;在腹腔注射75μgxa0LPS激发下,通过腹腔注射、滴鼻攻击BALB/c小鼠测定rSEB毒性,半数致死量LD50分别为20μg/kg、600μg/kg。本发明nSEB制备方法中B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落菌株购自ATCC(美国模式培养物集存库),保藏号为NO.14458;rSEB制备方法中pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落来源:可以通过简单的分子生物学手段获得,即PCR扩增ATCCxa0NO.14458菌株SEB基因,克隆入pGEM-7Zf质粒,转化入DH5α基因工程菌得到。本发明凭借其他治疗性抗体开发的经验、利用当代现有的科学技术研制的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂,可以有效地治疗与预防SEB,是非常有价值的治疗性和预防性抗体药物。本发明利用SEB免疫健康动物,产生高效价SEB的抗血清,去除能引起副作用的Fc片段,制备抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂,能特异中和SEB,对SEB的治疗和预防有特异性保护效果。附图说明:图1-1、抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂对SEB中毒小鼠的救治效果20只体重16-18g的BALB/c小鼠腹腔注射75μgLPS,2h后腹腔注射8μgxa0SEB,造成中毒症状后1h,1.5h,3h分别肌肉注射2mg/2ml精制抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂成品,注射抗体后观察72h。图1-2、抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂对预防小鼠SEB中毒的效果肌肉注射16-18g的20只Balb/c小鼠2mg/2ml抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂,12h后,腹腔注射8μgxa0SEB和75μgxa0LPS混合物攻击,攻击后观察72h。图2-1、抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂对SEB中毒恒河猴的救治效果10只体重2-3kg恒河猴腹腔注射30μgxa0SEB,中毒后1h、1.5h、3h分别肌肉注射5mg/5ml抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂,注射抗体后观察48h。图2-2、抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂对预防恒河猴SEB中毒的效果肌肉注射10只体重2-3kg恒河猴5mg/5ml抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂,12h后,腹腔注射30μgxa0SEB攻击,攻击后观察48h。下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。实验例1精制抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂对BALB/c小鼠的治疗和预防效果评价(1)通过对每只体重16-18g的BALB/c小鼠腹腔注射75μgLPS预先激发,2h后腹腔注射8μgxa0SEB(约20LD₅₀)建立了中毒致死模型,中毒后1h、1.5h、3h分别肌肉注射2mg/2ml本发明实施例1制备的精制抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂,注射抗体后观察72h。结果表明:未注射抗体对照组72h内全部死亡,治疗组无一死亡;治疗组注射抗体后症状迅速减轻。说明抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂对SEB中毒的动物有明显的治疗效果;(2)肌肉注射16-18g的Balb/c小鼠2mg/2ml本发明实施例1制备的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂,12h后,腹腔注射8μgxa0SEB和75μgLPS混合物攻击,攻击后观察72h。未注射抗体对照组72h内全部死亡,而预防组小鼠无一死亡,没有出现任何临床症状。说明本发明抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂对SEB中毒有明显预防效果;见图1-1和图1-2.实验例2精制抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂对恒河猴治疗和预防效果评价(1)通过对每只体重2-3kg恒河猴腹腔注射30μgxa0SEB建立了中毒模型,4h内恒河猴出现恶心、呕吐、腹泻、寒战等症状。中毒后1h、1.5h、3h分别肌肉注射5mg/5ml本发明实施例2精制的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂,注射抗体后观察48h。结果表明:同未注射抗体对照组恶心、呕吐、腹泻、寒战等症状持续不退相比较,治疗组注射抗体后症状迅速减轻至消失。说明本发明的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂对SEB中毒的恒河猴有明显的治疗效果;(2)肌肉注射体重2-3kg恒河猴5mg/5ml本发明实施例2制备的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂,12h后,腹腔注射30μgxa0SEB攻击,攻击后观察48h。同未注射抗体对照组4h内恒河猴出现恶心、呕吐、腹泻、寒战等症状相比较,预防组小鼠无一出现任何临床症状。说明本发明抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂对SEB中毒有明显预防效果;见图2-1和图2-2.实验例3精制抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体的安全性检定(1)精制抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂的检定按照本发明实施例1,2,3的方法制备3批抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液,经检定为无色或淡黄色透明液体,纯度高于95%,无异常毒性,无菌,无热原,效价高于20000U/瓶。(2)按照本发明实施例1,2,3的方法制备3批抗SEB免疫球蛋白成品,通过免疫组化证实与正常人心、肝、肺、肾、脑、脾、淋巴结、肠组织器官没有交叉反应,证实抗SEB免疫球蛋白没有抗人的组织成分,用于人的防治是安全的。(见表1)表1xa0xa0抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂的检定 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 实验例4精制抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体的稳定性检定(1)按照本发明实施例1,2,3的方法制备得到3批抗SEB免疫球蛋白成品,放4°C观察稳定性,实验证实抗SEB免疫球蛋白4°C放置18个月以上中和效价不减,有很好的稳定性;(2)按照本发明实施例1,2,3的方法制备3批抗SEB免疫球蛋白成品放37°C,通过加速试验观察稳定性,实验证实抗SEB免疫球蛋白37°C放置3个月以上中和效价不减,6个月时略有下降,有很好的稳定性。(见表2--3)表2、第1批抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂抗体在4°C的稳定性 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表3、第1批抗SEB免疫球蛋白F(ab′)₂抗体在37°C的稳定性 ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 下述实施例均能实现上述实验例的效果。实施例1一、制备rSEB免疫原(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,37°C过夜培养后,以1%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,32°C,1.0mM的IPTG诱导表达10h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达45%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到75%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,取沉淀;(3)将经过75%的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至200g/ml。将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以1ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经Bufferxa0A(5mMxa0PB,pH7.2)4°C过夜透析后,以5ml/min的流速上已平衡的SP阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用BufferB(5mMPB,0.5Mxa0NaClxa0pH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;(5)对纯化后rSEB纯品的纯化效果分析,经电泳测算其纯度大于98%,并测定蛋白质分子量,分子量约为28kDa;在腹腔注射75μgxa0LPS激发下,通过腹腔注射、滴鼻攻击BALB/c小鼠测定rSEB毒性,半数致死量LD50分别为25μg/kg、750μg/kg。二、制备nSEB免疫原(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,37°C过夜培养后,以1%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,37°C孵育48h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,12000rpm离心15min,取上清用聚乙二醇8000浓缩30倍,置截留量5000的透析袋中,在4°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为25ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取一定量粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75,用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为8ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,4°C保存备用;(4)对纯化后nSEB纯化效果分析,经电泳测算其纯度大于95%,并测定蛋白质分子量,分子量约为28kDa;在腹腔注射75μgxa0LPS激发下,通过腹腔注射、滴鼻攻击BALB/c小鼠测定rSEB毒性,半数致死量LD50分别为20μg/kg、600μg/kg。三、制备抗SEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂(1)将上述一、二中制备得到的SEB以等量混合后加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg。当免疫动物ELISA效价不低于1∶64000时采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10的S/D病毒灭活溶液(Tritonxa0X-10010%,TNBP3%)灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原体积再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心沉淀IgG,先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,超滤液为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调pH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调pH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤去Fc段,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)2抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)缓冲液线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤除盐、浓缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂原液。(5)将上述纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂用生理盐水稀释至每3ml含20000U,加入0.05mg/ml硫柳汞防腐剂,0.22um除菌分装,制备抗SEB免疫球蛋白注射剂成品。实施例2一、制备rSEB免疫原(1)挑取pGEM-7Zf-SEB/DH5α单菌落于含50μg/ml的LB培养基中,37°C过夜培养后,以1%接种量转接新鲜培养基中,当OD600达到0.6~0.8时,32°C,1.0mM的IPTG诱导表达10h,离心得菌体,纯水洗1次,用0.1mM,pH7.0的Tris-HCl溶解,超声波破碎,离心去菌体,取上清;(2)将固体硫酸铵加入收集的上清液中,使其饱和度达45%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,收集上清后继续加入硫酸铵,使其饱和度达到75%,4°C放置5h,12000rpm离心10min,取沉淀;(3)将经过75%的硫酸铵沉淀的蛋白样品溶解于1M硫酸铵溶液中,调蛋白浓度至200g/ml。将两疏水柱Phenyxa0lxa0FF和Phenyxa0lxa0HP串联后用1M的硫酸铵平衡,再将样品以1ml/min的流速过此串联疏水柱,收集穿透液;(4)穿透液经Bufferxa0A(5mMxa0PB,pH7.2)4°C过夜透析后,以5ml/min的流速上已平衡的SP阳离子柱,待紫外吸收值回到基线后,用Bufferxa0B(5mMPB,0.5Mxa0NaClpH7.4)进行线性梯度洗脱,收集蛋白峰;(5)对纯化后rSEB纯品的纯化效果分析,经电泳测算其纯度大于98%,并测定蛋白质分子量,分子量约为28kDa;在腹腔注射75μgxa0LPS激发下,通过腹腔注射、滴鼻攻击BALB/c小鼠测定rSEB毒性,半数致死量LD50分别为25μg/kg、750μg/kg。二、制备抗rSEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂(1)将上述一中制备得到的SEB加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg。当免疫动物ELISA效价不低于1∶64000时采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10的S/D病毒灭活溶液(Tritonxa0X-10010%,TNBP3%)灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原体积再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心沉淀IgG,先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,超滤液为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤去Fc段,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)2抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)缓冲液线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤除盐、浓缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂。(5)将上述纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂用生理盐水稀释至每3ml含20000U,加入0.05mg/ml硫柳汞防腐剂,0.22um除菌分装,制备抗SEB免疫球蛋白粘膜剂成品。实施例3一、制备nSEB免疫原(1)挑取产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman培养液中,37°C过夜培养后,以1%接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman固体培养基平板表面,37°C孵育48h,用无菌生理盐水收获刮洗菌苔,12000rpm离心15min,取上清用聚乙二醇8000浓缩30倍,置截留量5000的透析袋中,在4°C条件下对pH5.8,8mMxa0PB充分透析平衡;(2)取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32,依次以不同离子强度的PB:pH5.8,8mM、pH6.6,35mM和pH6.8,0.2M进行阶段洗脱,流速控制为25ml/h,收集35mM洗脱峰,用pH5.8,2mMxa0PB充分透析平衡;(3)取一定量粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadexxa0G-75,用pH5.8,2mMxa0PB洗脱,流速控制为8ml/h,收集第二个洗脱峰,对蒸馏水充分透析脱盐,真空冷冻干燥,为纯化的nSEB,4°C保存备用;(4)对纯化后nSEB纯化效果分析,经电泳测算其纯度大于95%,并测定蛋白质分子量,分子量约为28kDa;在腹腔注射75μgxa0LPS激发下,通过腹腔注射、滴鼻攻击BALB/c小鼠测定rSEB毒性,半数致死量LD50分别为20μg/kg、600μg/kg。二、制备抗nSEB特异性免疫球蛋白F(ab’)₂(1)将上述一中制备得到的SEB加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原,采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物,间隔21天,免疫四次,免疫剂量分别为2mg、4mg、8mg、16mg。当免疫动物ELISA效价不低于1∶64000时采集血浆,-70°C保存备用;(2)向血浆中加入1/10的S/D病毒灭活溶液(Tritonxa0X-10010%,TNBP3%)灭活外源病毒,后加入0.074%硅藻土,搅拌后用滤板过滤,用无热源2倍蒸馏水稀释,后加入21%饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白,上清再加入9%饱和度硫酸铵混匀离心沉淀IgG,用无热源蒸馏水恢复原体积再用30%饱和度的硫酸铵混匀、离心沉淀IgG,先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9%氯化钠溶液,后用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,超滤液为纯化抗SEBxa0IgG;(3)纯化抗SEBxa0IgG用盐酸调PH至3.2后,胃蛋白酶切割,再用氢氧化钠调PH至7.4,加热58°C、30min,用帆布过滤去Fc段,滤液为初步纯化抗SEB免疫球蛋白F(ab’)2抗体;(4)初步纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂抗体过DEAExa0Sepharosexa0Fastxa0Flow层析,柱平衡后,样品液上柱,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.0)缓冲液洗脱,收集样品峰,回流液直接上Qxa0Sepharosexa0Fastxa0Flow柱,完毕,用10mMxa0PB(pH7.4)洗柱至各基线平,用10mMxa0PB,1Mxa0NaCl(pH7.4)缓冲液线性洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤除盐、浓缩,用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8°C冷库保存,得到纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂。(5)将上述纯化的抗SEB免疫球蛋白F(ab’)₂用生理盐水稀释至每3ml含20000U,加入0.05mg/ml硫柳汞防腐剂,0.22um除菌分装,制备抗SEB免疫球蛋白注射剂。